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羊传染性脓疱病毒VEGF基因的克隆及分析

材料写作网    时间: 2020-09-19 04:04:57     阅读:

摘要:根据发表的羊传染性脓疱病毒参考株S-1的序列设计一对引物,以羊传染性脓疱病毒感染的原代犊牛睾丸细胞提取总DNA为模板,PCR扩增得到426bp片段,PCR产物克隆至pMD18-T载体,鉴定后测序。序列分析结果表明,毒株Orf-ys的VEGF基因与参考毒株的相关基因核苷酸同源性从4.4%到97.8%不等。基因进化树比较显示,与美国的Orf-11株和日本的Matsumoto株、R-1株及S-1株的进化关系最近。

关键词:羊传染性脓疱病毒;克隆;序列分析

中图分类号:S85文献标识码:A文章编号:1674-0432(2011)-02-0176-2

羊传染性脓疱病(Contagious ecthyma) 俗称羊口疮(Orf),是由羊传染性脓疱病毒(Orf virus)引起的一种接触性、嗜上皮性人畜共患传染病。近年来该病屡有爆发,出现再流行的趋势,世界各地均有该病的报道[1-3]。郑长有等报道一例(2005年)山西省保德县养殖场饲养的山羊突然发生羊传染性脓疱,发病率为40%,死亡率为30%[4]。羊传染性脓疱病毒的开放阅读框ORF132基因即VEGF基因,它表达血管内皮生长因子样蛋白质,是Orf病毒的毒力构成因子,是刺激宿主免疫应答的主要抗原之一[5]。因此,本实验对分离株Orf-ys的VEGF基因进行克隆并测序、进行序列分析以及构建系统进化树,目的在为研究本病的流行规律和研制新型疫苗做好研究基础。

1 材料与方法

1.1 试剂

常规分子生物学试剂、DNA聚合酶、E.coli DH5α及pMD18-T载体均购自大连宝生物公司。质粒提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒购自Vitagene公司。

1.2 病毒培养

Orf-ys株为本实验室分离鉴定所有,按1mL量接种传代犊牛睾丸细胞(100mL培养瓶),培养4-5d,待70-80%的细胞出现CPE时收获细胞及上清,冻融3次。

1.3 VEGF基因的克隆

1.3.1 PCR引物设计 参照发表的Orf基因序列,利用Primer 5.0 软件自行设计一对引物,两端分别添加EcoR I 和Sal I 酶切位点,上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

Orf V-F: 5’-GAATTC ATGAGGTTGCTCGTCTGCAT-3’

Orf V-R: 5’-GTCGACCTAATAAGCCCTTCGGCGCC-3’

1.3.2 PCR扩增模板基因组提取 将出现病变的细胞培养瓶中的单层细胞反复冻融3次,加入SDS和蛋白酶K至终浓度分别为5mL/L和0.2mg/L进行消化,以Tris平衡酚溶液、氯仿-异戊醇溶液反复抽提细胞基因组DNA两次,溶于TE缓冲液中。PCR反应的总体系为50μL:10×PCR Buffer5μL;dNTPs(各2.5mmol/μL)4.0μL;ExTaq DNA聚合...

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