不对称PCR扩增检测土壤中的肠道病原菌
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摘 要：主要研究内容为通过对最佳反应总体系、反应时间和反应温度等条件进行探索，建立用不对称PCR扩增技术检测土壤中典型肠道病原菌的实验条件。实验主要目的是通过不对称PCR扩增技术获得大量的单链DNA，为用基因芯片方法检测土壤中的典型肠道病原菌做准备。应用不对称PCR扩增检测技术对样品进行荧光标记后，与寡核苷酸基因芯片进行杂交，可以提高杂交效率。
关键词：不对称PCR 土壤 典型病原菌
中图分类号：X17 文献标识码：A 文章编号：1672-3791（2016）11（b）-0062-02
不对称PCR是指反应体系中两条浓度不一样的引物，在PCR扩增的后期，当其中量少的一条引物被消耗完以后，另一条继续以线性扩增的方式，产生大量的扩增产物单链 DNA。部队称PCR扩增检测技术可以应用的范围相对较为广泛：如配合RT-PCR扩增技术研究真核DNA外显子、制备单链探针、DNA序列分析等，在寡核苷酸基因芯片的检测应用方面，不对称PCR在标记单链样品方面比常规PCR更有优势，与寡核苷酸芯片杂交效率也较高。
1 材料与方法
1.1 土壤样品
研磨过筛（20目），-80 °C保存备用。
1.2 主要试剂及试剂盒
主要试剂及试剂盒：引物、dNTP、50 bp DNA Ladder，100 bp DNA Ladder、Taq DNA聚合酶、琼脂糖、FastDNASPIN Kit for Soil试剂盒（MP Biomedicals，Solon，OH，USA）。
1.3 主要仪器
凝胶成像系统（Bio-Rad Laboratories，Segrate，Italy），PTC-100 PCR仪（MJ Research，Waltham，MA，USA），Mini-BeadBeater-16TM核酸提取仪（Biospec products，USA），DYY-8B型电泳仪（北京市六一仪器厂）FastPrepTM FP120核酸提取仪（Bio 101，Carlsbad，USA），高速离心机（上海安亭）。
1.4 DNA提取
利用FastDNA SPIN Kit for Soil试剂盒与Mini-BeadBeater-16TM核酸提取仪提取土壤DNA。主要过程参见FastDNASPIN Kit for Soil试剂盒。
1.5 引物合成
参照文献[1-2]合成引物：UP1：GAAGTCATCATGACCGT
TCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA，P2r：AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRT
CNGTCAT（R指的是A或者G，Y指的是C或者T，N代表任何碱基）。
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