烟草叶片原生质体制备及其在蛋白互作研究中的应用
摘要 [目的]获得高产量的烟草叶片原生质体。[方法]在前人的基础上，在酶浓度和酶解时间上，对简易大量制备本氏烟叶原生质体的条件进行了进一步的探索；并以此为基础，通过双分子荧光互补试验进一步研究了其在蛋白互作研究中的应用。[结果]在纤维素酶浓度为1.3%，离析酶浓度为0.4%，果胶酶浓度为0.3%，酶解4 h，酶解温度28 ℃，并在简易纯化的条件下制备原生质体，所得到的完整原生质体产量最高，并且细胞碎片和杂质均最少。[结论]该方法为瞬时表达于本氏烟叶中的荧光蛋白研究提供了重要的技术参考。
关键词 烟草（Nicotiana benthamiana）；原生质体制备；双分子荧光互补试验；蛋白互作
中图分类号 S572 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2014）16-05002-05
植物原生质体（protoplast）一词始自Hanstein，即指通过质壁分离，脱去细胞壁的细胞[1]。细胞壁是植物细胞的围墙，用其相对坚固的结构包围着其内部的原生质体，保护和支撑着植物细胞，其主要成分为纤维素、半纤维素、果胶质和少量蛋白质等。在原生质体的所有分离方法中，酶解法效果最佳[2]。随着植物生物学的发展，原生质体已经越来越广泛应用于植物生理学、细胞生物学、体细胞遗传学等研究领域[1]，是生理生化研究、基因表达调控研究、基因定位研究、细胞器制备、细胞融合和新品种培育等研究的理想材料[3]。
目前，原生质体在植物分子生物学领域应用非常广泛，其中就包括蛋白亚细胞定位和蛋白间相互作用研究。亚细胞定位是指某种蛋白或表达产物在细胞内的具体存在部位。例如在核内、胞质内或者细胞膜上存在。GFP是绿色荧光蛋白，将所研究蛋白与GFP融合构建到一个同框阅读框内，然后转化到植物中，提取原生质体，在扫描共聚集显微镜的激光照射下观察绿色荧光信号，从而可以精确地定位蛋白质在细胞中的位置。植物原生质体双分子荧光互补试验（简称BiFC）使得活细胞内的蛋白互作可视化[4]。这种方法被成功的应用到不同生物中的不同表达系统。BiFC的基本原理是，增强的黄色荧光蛋白（eYFP）的片段通过分别融合到其末端的连接蛋白的互作重新形成荧光复合体。蛋白复合体的荧光能清晰观察到荧光的空间定位，如果连接的2个蛋白不互作，则只会形成背景荧光[5-6]。
烟草作为一种模式植物，其发育生长周期非常快，在短期内就能繁育多代。且易于进行农杆菌侵染试验，荧光蛋白分子在烟草内瞬时表达后，易于观察。国内外众多研究者提出了许多制备烟草原生...
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