粪便中小肠结肠炎耶尔森菌PCR检测方法的建立
[摘要] 小肠结肠炎耶尔森菌是一种人畜共患的病原菌。它在自然界中广泛分布,包括人、猪、牛等哺乳动物,禽类的排泄物,蜗牛等冷血动物,昆虫,未处理的冷水,污水,肉,乳制品,蛋制品,水产品和冰激凌。所致疾病主要有胃肠炎型和肠道外型。我科应用PCR方法检测小肠结肠炎耶尔森菌,及时发现患者和带菌者,为流行病学提供实验室依据,及时控制传染源,为预防疾病起重要作用。
[关键词] 小肠结肠炎耶尔森菌;PCR检测方法;病原菌
[中图分类号] R37[文献标识码]A [文章编号]1673-7210(2010)02(b)-023-03
小肠结肠炎耶尔森菌所致疾病在世界上广泛分布,但多集中在寒冷地区,在我国东北地区小肠结肠炎耶尔森菌各血清型的分布亦较广泛。本菌可感染人类以及多种动物,包括家畜、兽类、禽类、鸟类和昆虫,并通过排泄物和污染的水、食品传播。
1 实验方法
1.1 试剂
干燥培养基(北京陆桥生物技术有限公司);生物梅里埃API20E生化条;诊断血清。
1.2 仪器
美国BIO-PCR仪;Thermo生物安全柜;离心机。
1.3 样品采集
采集急性期、用药前采集患者新鲜粪便标本8例,每份2～5 g,放入Cary-Blair半固体保存培养基中,4℃冷藏运送至实验室。
1.4 操作
1.4.1 增菌
取1 g粪便接种于10 ml改良PBS培养基上,置于4℃冷增菌10～20 d。在冷增菌的第7、14、21天划线接种于耶尔森选择性平板、麦康凯平板,25℃培养24 h。增菌管内液体量较大,在接种前应轻轻混匀,再用接种环挑取液体,接种于预先准备好的上述平板,采取分区划线的方式,一般划3～4区,目的是划出单个菌落。由于总体菌量一般不大,每区划完后可不必烧灼接种环,直接划下一区即可。
1.4.2 培养
直接取粪便标本接种选择性平板(耶尔森选择性平板、麦康凯平板),25℃培养24 h。
1.4.3 鉴定
1.4.3.1 形态学鉴定在耶尔森选择性培养基上25℃培养24 h,形成较小的湿润菌落,直径为1～2 mm。中心呈深玫瑰红色,凸起较尖锐,周围有明显的透明环,称'公牛眼“。麦康凯平板25℃培养24 h,形成直径为0.5～1.0 mm的小菌落,菌落为圆形、光滑、湿润、扁平略有凸起、半透明,中央有极淡的粉色[1]。
1.4.3.2 生化鉴定从选择性培养基上挑取5个可疑菌落进行生化鉴定。
改良克氏双糖试验:挑取可疑菌落接种于改良克氏双糖斜面(用甘露醇取代乳糖),25℃培养24～48 h[2]。挑选斜边、底层均变为黄色(A/A)、不产H2S、不产气的菌株进...
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