RQ—PCR技术及应用进展
摘要：传统PCR技术虽然因为其灵敏性、特异性和快速性，自发明以来取得了广泛应用，但仍存在容易交叉污染而产生假阳性及定量不准确的缺陷。而实时荧光定量PCR（RQ-PCR）技术实现了从定性到定量的飞跃，由于其操作方便、反应速度快、灵敏度高、重复性好、定量准确等优点成为了分子生物学研究中的重要工具。
关键词：RQ-PCR；荧光探针；分子生物；荧光共振能量转移
中图分类号：O657 文献标识码：A 文章编号：1009-2374（2013）13-0044-02
1 RQ-PCR技术概述
RQ-PCR是FPET（荧光共振能量转移）技术在PCR定量上的应用。其指在PCR反应体系中加入荧光基团，在指数扩增期间通过连续监测荧光信号出现的先后顺序及强弱变化实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。RQ-PCR同步进行定量和扩增，这样就克服了传统PCR的平台效应，减少了终点检测带来交叉污染的机会，也克服了终点法定量的不准确性。另外，RQ-PCR无需再处理，节约了时间和精力，更避免了放射性同位素可能给实验人员造成的伤害。目前，RQ-PCR在分子生物学研究中应用越来越多。
1.1 荧光共振能量转移
当一个荧光基团的荧光光谱与另一个荧光基团的激发光谱重叠，并且两个基团距离足够近时，供体荧光基团的激发能诱发受体基团发出荧光，同时供体荧光基团自身的荧光强度衰减，即能量从短波长的荧光基团传递到长波长的荧光基团，相当于短波长荧光基团释放的荧光被屏蔽，这个过程称为FRET。
1.2 参照物
参照物有外参照和内参照两种。外参照不与目的基因在同一反应体系中扩增。以已知浓度的目的基因为模板按一定比例稀释，制备标准曲线。而未知标本则根据该标准曲线得出相对的拷贝数和Ct值。其优点是可以和目的基因保持较高的同源性，保证了二者的扩增效率近似。缺点是不能克服也无法检测可能出现在样本反应体系中的影响因素。内参照是在各标本中加入已知浓度的内参照基因，与样本一起抽提、扩增。内参照基因的DNA片段与目的基因相似。为保证目的基因只能与内参照探针结合，运用定点突变的方法改变与探针结合的中间部位的序列。内参照系统的结果重复性更好，可以避免不同抽提效率导致的样本间差异。
1.3 RQ-PCR几个重要参数
（1）荧光域值3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍设置为荧光域值的缺省，荧光本底信号为PCR反应的前15个循环的荧光信号；（2）Ct值中C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的...
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