基于免培养技术的食用菌病害微生物rDNA测序及初步分析
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作者简介:高 能(1986-),女,硕士研究生,主要从事食用菌栽培、遗传育种及食用菌病害研究。
通讯作者,E-mail:sdgzy2656@126com
摘要:采用CTAB结合DNA凝胶回收试剂盒法提取四种主要食用菌病害组织样品的宏基因组DNA,用16S rDNA和18S rDNA通用引物分别对样品的基因组DNA进行PCR扩增、连接、转化并进行单克隆测序。每对引物随机挑取20个阳性克隆的rDNA序列进行比对,并对病害微生物的亲缘关系进行了初步分析,结果表明四种病害样品中两种为细菌性病害,两种为真菌性病害。
关键词:免培养;食用菌病害;rDNA 序列分析
中图分类号:Q789 文献标识号:A 文章编号:1001-4942(2013)06-0011-05
食用菌病害研究的传统检测方法主要包括分离、纯化、显微观察、染色技术、生理生化测定等[1],所需时间长,准确性较低,往往需要结合其他鉴定技术(如PCR等分子技术)来提高其准确性。
自Pace等[2]首次提出环境宏基因组学、Handelsman等[3]提出基因组的定义以来,宏基因组学已作为新的分子生物学方法,成功应用于土壤[4]、海洋[5]环境微生物及消化道等菌群[6,7]的多样性研究中。宏基因组技术是以样品中的微生物群体总基因组作为研究对象,利用测序分析等生物信息学方法,基于非培养方式进行微生物群落多样性、种群结构、进化关系、功能活性、相互协作关系等的研究。本试验基于免培养技术直接提取病害样品的宏基因组DNA,以16S rDNA/18S rDNA为靶基因进行病害微生物鉴定及亲缘关系初步分析,为食用菌病害的分子检测方法研究提供了依据。
1 材料与方法
11 试验材料
111 材料 样品1为平菇黄腐病病样(PG,图1A),采自济南平阴县孔村镇食用菌基地;样品2为双孢菇褐斑病病样(SBG,图1B),采自菏泽市定陶县马集乡牛杨村双孢菇种植基地;样品3为鸡腿菇黑头病病样(JTG,图1C),采自济南平阴县孔村镇食用菌基地;样品4为金针菇疑似胡桃肉状菌病病样(JZG,图1D),采自济南遥墙食用菌种植基地。
112 试剂 CTAB、Tris碱、EDTA、SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒、Taq PCR Master Mix、SanPrep柱式PCR产物纯化试剂盒等分子试剂,均购自上海生工生物工程有限公司。
113 引...
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