石斑鱼神经坏死病毒的RT—LAMP检测方法的建立
摘 要 利用反转录环介导等温扩增技术（RT-LAMP）建立一种方便、快捷的石斑鱼神经坏死病毒（NNV）检测方法。根据石斑鱼神经坏死病毒衣壳蛋白基因序列的保守区设计5组特异引物，提取斜带石斑鱼的总RNA，利用RT-LAMP技术比较5组引物的敏感性和特异性，同时对反应温度和反应时间进行优化，并对现场20尾鱼苗进行了检测。结果表明：筛选出一组高特异性的引物，在61 ℃条件下恒温反应20 min可以完成检测；在反应试管中添加钙黄绿素，可利用荧光反应现象进行结果判定，且对9种常见鱼类病原微生物无交叉反应；对20尾鱼苗进行了现场检测，检测结果与RT-PCR结果一致。本研究成功建立起石斑鱼神经坏死病毒RT-LAMP检测方法，方法特异性强、反应时间短、操作简单，为进一步推广该技术在现场大规模的应用奠定了研究基础。
关键词 石斑鱼；神经坏死病毒；RT-LAMP；检测方法
中图分类号：S943 文献标志码：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2017.32.040
鱼神经坏死病毒（Nervous necrosis virous，NNV）是一种世界范围内流行、严重危害多种海水和淡水鱼类的传染性病原，可以导致鱼类病毒性神经坏死病，又称病毒性脑病和视网膜病。该病毒具有极高的传染性和危害性，严重情况下，仔鱼和幼鱼的死亡率可以达到100%[1]。目前，使用的检测方法有显微镜观察法、免疫学方法、分子生物学方法和细胞培养法，这些检测方法普遍存在技术要求高、操作复杂和耗时长等特点，无法满足现场的大规模应用。
环介导等温核酸扩增（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是一种新型的核酸扩增技术。由于LAMP技术具有高灵敏度、强特异性、快速简便、成本低廉等特点，使其广泛应用于病原菌的检测、胚胎性别鉴定、食品卫生检测等方面[2]。本研究利用RT-LAMP检测技术，建立了斜带石斑鱼神经坏死病毒的快速检测方法。通过對比选取了特异性好的一组扩增引物，并优化了反应时间、反应温度等条件，检验了该方法的灵敏性和特异性，最终建立了一套不依赖复杂设备，操作简单，只需肉眼观察就可以实施的检测方法。
1 材料与方法
1.1 材料
感染了NNV的斜带石斑鱼和健康的斜带石斑鱼均由福建水产研究所提供；动物组织/细胞RNA提取试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司；LA-320c环介导等温扩增实时浊度仪、Loopamp RNA扩增试剂盒和Loopamp荧光检测试剂盒购自北京蓝谱生物科技有限公司；RNA提取试剂盒购自北京康为世纪生物科技...
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