在毕赤酵母中表达的重组疟疾疫苗(PfCP-2.9)的纯化研究
摘要:文章对毕赤酵母工程菌GS115/pPIC9K-PfCP2.9表达的重组疟疾疫苗PfCP2.9的纯化工艺进行了研究。研究表明,分泌在发酵上清液中的目的蛋白,先后经Phenyl疏水层析,超滤更换缓冲液,Q强阴离子交换层析,SP强阳离子交换层系和Superdex75凝胶过滤层析,获得纯度大于98%的目的蛋白,蛋白得率为50%,Wetern-blot分析其具有免疫原性,能够满足后续临床试验用药的要求,为疫苗的产业化铺平了道路。
关键词:重组疟疾疫苗;毕赤酵母;蛋白纯化;疫苗产业化
中图分类号:R382文献标识码:A文章编号:1009-2374 (2010)13-0047-03
疟疾是人类最古老的传染病之一,至今仍在全球肆虐。目前约40%的世界人口仍处在疟疾威胁之中,每年有3～5亿人感染疟疾,其中约100~300万人死亡,大多数为儿童和孕妇。现在研究者普遍认为,研制安全、价廉和有效的疟疾疫苗是人类控制乃至根除疟疾的重要途径。在众多的疟疾候选抗原中,高度保守的裂殖子表面蛋白1(MerozoiteSurfaceProteinl,MSP-l)C末端19kD片段(MSP1-19)和裂殖子顶端膜抗原l(ApicalMembraneAntigenl,AMA-1)是目前两个最有希望的红内期亚单位疫苗。上海第二军医大学病原微生物教研室己经成功构建了由MSP1-19和AMA-1的Ⅲ亚区〔AMA-1(Ⅲ)〕通过接点序列连接而成的融合蛋白,定名为PfCP-2.9,并在毕赤酵母中得到了高水平表达。本文主要研究了毕赤酵母表达的融合抗原PfCP-2.9的纯化工艺,实现了融合抗原的大规模制备,为疫苗的产业化铺平了道路。
一、材料与方法
(一)材料
1.试剂PhenylSepharoseF.F.填料、QSepharoseF.F.填料、SPSepharoseF.F.填料、Superdex75pg60/600预装柱均为GE公司产品;硫酸铵为Amersco公司进口分装;0.45/0.22μm滤膜为Sartorius公司产品;单抗5.2、RabbitantiPfCSP190,第二军医大学病原微生物教研室提供;羊抗兔IgG一AP标记,华美生物工程公司;其它试剂均为国产分析纯。
2.仪器上海离心机研究所高速冷冻连续流离心机;AKTAPurifier,UVis920检测器,各规格层析柱均为GE公司产品;Waterson520R蠕动泵,美国Bio-rad电泳系统,Sartorius公司MWCO10KD超滤系统。
(二)方法
1.PhenylSepharoseF.F.疏水层析发酵液14000rpm离心,取上清过0.45/0.22μm滤膜;加入2mol/L(NH4)2SO4至终浓度为1.2mol/L并调节pH值至6.5,静置30min后,过0.45/0.22μm滤膜;上经A液 (20mmol/L柠檬酸/磷酸氢二钠+1.2mol/L硫酸铵,pH6.5)平衡好的柱子后,用A液淋洗至无蛋白流出,用B液(20mmol/L柠檬酸/...
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