病原微生物原位杂交检测法实验综述
摘要 原位杂交法近年来广泛用于生物和医学领域，其实验技术有很强的应用价值。阐述了病原微生物原位杂交检测法的实验地位和作用、实验课的设计思路和实验内容。
关键词 病原微生物；原位杂交；地高辛标记；实验综述
中图分类号 R446.6 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2013）09-0335-01
根据安庆师范学院生命科学学院课程设置情况，微生物学是主干基础学科，且学校注重学生实践技能的培养。结合生命科学前沿动态，病原微生物关系到居民生活和健康，是近年来的研究的热点。以地高辛标记的原位杂交技术，在医学、免疫学和基因组学等领域发展十分迅速，以应用性为导向，制定了该实验方案。
1 实验原理
1.1 病原微生物
病原微生物是指侵入机体后引起感染的病原体。常见的病原微生物有大肠杆菌、沙门氏菌和单增李斯特菌等。
1.2 原位核酸分子杂交技术
简称原位杂交技术。可将特定的基因或者核酸序列直接定位在染色体上，其灵敏度和敏感性高，不用提取组织核酸而且不受细胞中其他成分影响，较好地保存了细胞结构和形态。可用于外源DNA的鉴定，本实验用于定性和定位病原微生物。将细胞经适当处理后，其通透性增加，用标记好的序列已知的核苷酸单链作为探针，进入细胞，根据碱基互补配对的原则，与组织或细胞中待检测的核酸序列，发生特异性结合，形成杂合体。选择与标记物对应的检测系统，使用荧光检测或者化学显色的方法，杂交体在细胞原位形成带有颜色的杂交信号[1]。
1.3 随机引物法地高辛标记探针原理
以DNA单链为模板，合成双链的过程中，用同位素标记4种核苷酸底物中有1种，则在与模板序列配对的许多位置，会形成放射性探针；若用DIG-11-dUTP代替dTTP，则产生地高辛标记的探针。标记的探针DNA 的平均长度越长，引物的浓度越低[2]。
1.4 探针的选择
用于原位杂交的探针有RNA、ssDNA和dsDNA。如用于检测RNA样品，称为Northern杂交；如用于检测DNA样品，称为Southern杂交。根据病原微生物种类选择合适的探针，可根据探针来源和性质分为DNA 探针、cDNA 探针、RNA 探针及人工合成的寡聚核苷酸探针等[3]。探针长度一般在100～400个碱基，寡聚核苷酸探针（16～30个碱基），短核苷酸探针能自由出入细菌细胞壁，杂交效率比长探针高。
1.5 标记物的选择
标记物可以是放射性同位素，也可以是非放射性生物素和半抗原等。但因同位素对人体伤害较...
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