甘蔗宿根矮化病病原菌一推测膜蛋白基因（Lxx18460）单克隆抗体的制备和检测
摘要：【目的】对甘蔗宿根矮化病病原菌（Leifsonia xyli subsp. xyli， Lxx）一推测为抗K因子的膜蛋白基因（Lxx18460）进行研究，为今后研究该基因在感病甘蔗体内表达打下基础。【方法】诱导表达并纯化含有推测为抗K因子的膜蛋白Lxx18460基因的pET-30a质粒菌液，委托南京金斯瑞生物科技有限公司制备单克隆抗体；用Western blotting对细菌及感病和健康甘蔗样品总蛋白进行检测。【结果】Lxx18460基因具有特异性，只存在于甘蔗Lxx中。ELISA单克隆抗体效价大于 1∶512000，能够灵敏地检测细菌总蛋白和甘蔗样品蛋白。Western blotting检测结果表明，Lxx18460基因在细菌中和感病甘蔗样品中表达，在健康甘蔗样品中几乎不表达。【结论】Lxx18460基因具有特异性，是Lxx中的抗K因子的膜蛋白基因，能够在细菌和感病甘蔗样品体外进行表达。
关键词： 甘蔗宿根矮化病；Lxx18460基因；单克隆抗体；ELISA检测；Western blotting检测
中图分类号： Q-331 文献标志码：A 文章编号：2095-1191（2016）03-0382-07
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【研究意义】甘蔗宿根矮化病（Ratoon stunting disease， RSD）是普遍存在于植蔗地区的一种世界性重要病害（马丁等，1982；黄应昆和李文凤，2002），其病原为棒状杆菌属Leifsonia xyli subsp. xyli（Lxx） （Davis et al.，1980），寄生于蔗株的维管束中，受害甘蔗发育慢，植株矮小，严重影响甘蔗产量和品质，且该病原细菌特别细小，分离、培养和检测都极其困难。 因子是细菌RNA聚合酶全酶（α2ββ’ ）的一个蛋白质亚基，它可以识别目的基因启动子区域，促进该区域与RNA聚合酶全酶的结合（Chan et al.，2008），而抗 因子能通过影响 因子的作用抑制转录。因此，对Lxx中抗 因子进行研究，对于防治RSD具有重要意义。【前人研究进展】AsiA是大肠杆菌σ70 RNA聚合酶基因转录的一种抑制子，亦即抗 因子，Urbauer等（2002）通过将AsiA亚克隆进pET-24b表达载体并转化进大肠杆菌BL21（DE3）菌株中诱导表达，其大小约10 kD，进一步分析表明该蛋白以二聚体的形式存在，是一种新型的螺旋折叠结构，它的表达会导致宿主基因转录关闭。RseA是大肠杆菌中跨膜的抗 因子，Campbell等（2003）采用PCR扩增目的片段DNA，构建σE和RseA的表达载体，转入大肠杆菌BL21（DE3）菌株中诱导表达并进行共纯化，结果表明，RseA能够与 E结合，从而抑制转录。周丹（2012）克隆了Lxx中推测为抗 K因子的膜蛋白Lx...
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