利用TAIL—PCR技术克隆南极磷虾胰蛋白酶基因
摘要：目的 研究南极磷虾胰蛋白酶基因的全序列，为低温酶的基因工程制备建立基础。方法 以南极磷虾基因组DNA为模板，利用特异性的巢式引物和随机引物，通过交错式热不对称PCR （Thermal asymmetric interlaced polymerase chain reaction， TAIL-PCR） 克隆南极磷虾胰蛋白酶基因序列，并进行序列分析。结果 测序结果表明，南极磷虾胰蛋白酶基因序列全长961bp，其中含有开放阅读框（ORF）长度为798bp，编码266个氨基酸。结论 本实验成功克隆了南极磷虾胰蛋白酶基因，为进一步了解该酶的结构、功能和基因工程制备奠定了基础。
关键词：南极磷虾；TAIL-PCR；胰蛋白酶；基因
胰蛋白酶是动物消化系统中主要的一种碱性蛋白水解酶，属丝氨酸蛋白酶家族，能专一性地水解肽链中赖氨酸和精氨酸的羧基所形成的肽键。南极磷虾因其独特的生活环境，体内的胰蛋白酶具低温高效性，有研究表明，南极磷虾胰蛋白酶在37℃和1～3℃时的活性分别是牛胰蛋白酶活性的12倍和60倍[1]。深入研究该酶对适冷性酶酶学性质的探究、蛋白质工程体系的完善具有极高的价值。目前获得南极磷虾胰蛋白酶的方法主要是组织提取，这不仅步骤繁琐而且成本高昂。本文旨在克隆南极磷虾胰蛋白酶基因，为进一步在工程菌中表达以大量获得南极磷虾低温酶奠定基础。
交错式热不对称PCR （Thermal asymmetric interlaced polymerase chain reaction， TAIL-PCR）是一种快速有效扩增已知DNA序列侧翼未知序列的方法[2-3]，由Liu和Whittier[4]首次报道该技术。目前许多基因的克隆都是通过这个方法获得，马春骥等[5]用TAIL-PCR成功克隆了绵羊肺炎支原体Y98株的未知基因Hsp70 （DnaK） ，张伟涛等[6]利用TAIL-PCR克隆了一种耐盐基因。
1 材料与方法
1.1材料 南极磷虾冰冻样本2012年取自南冰洋水域48.1区，限制性核酸内切酶BamHⅠ、EcoRⅤ、PrimeSTAR Max DNA Polymerase、Genome Walking Kit购自Takala公司，pEASY-Blunt Cloning kit、pEASY-T1 Cloning Kit购自全式金公司，TIANamp Marine Animals DNA Kit购自天根生化科技（北京）有限公司，DNA Engine Dyad PCR仪产自美国Bio-RAD公司，PCR引物由北京华大基因公司合成。
1.2南极磷虾基因组DNA的提取 南极磷虾为本课题组参加南极科考任务所取样品，取其尾节肌肉组织提取DNA，按照动物组织基因组DNA提取试剂盒说明书进行基因组DNA提取。
1.3南极磷虾胰蛋白酶基因...
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