红枣中链格孢菌的多重PCR检测
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摘要：为快速、灵敏并且特异性地检测红枣中链格孢菌，选取2对链格孢菌特异引物，优化多重PCR检测中的引物比例、退火温度、dNTP浓度及Mg2+浓度等条件，结果表明多重PCR扩增出了预计的链格孢菌PCR产物，优化的条件为Alt-F2＼R2 ∶Alt-F1＼R1=3 ∶1、退火温度52 ℃、dNTP浓度0.05 mmol/L、Mg2+浓度1.5 mmol/L。该方法在检测红枣链格孢菌中具有很好的应用和开发前景。
关键词：红枣；链格孢菌；多重PCR；检测
中图分类号： TS207.4 文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2016）09-0301-02
红枣（Zizyphus jujuba Mill.）是集营养、保健于一体的优质干果，含有丰富的多糖、维生素C、黄酮、cAMP等成分[1-2]，但红枣在自然条件下贮藏容易发生真菌病害侵染引起的霉变，在霉变过程中，真菌产生的二次代谢产物真菌毒素具有很强的毒性，会给食用者带来危害[3-4]。近年来的研究表明，链格孢菌是红枣霉变中的主要真菌之一[5-7]，因此对其进行快速准确地检测，对控制红枣产品的安全性具有重要意义。
多重PCR检测技术具有快速、简便且特异性的优点，在许多植物真菌的检测中得到广泛应用[8-10]，但对枣中链格孢菌的多重PCR检测尚未见报道。本研究针对枣中链格孢菌特菌Alt-F1＼R1扩增片段和Alt-F2＼R2扩增片段设计引物，采用多重PCR对其进行鉴定，研究其多重PCR检测条件，旨在为枣产品的链格孢菌检测提供一种新方法。
1 材料与方法
1.1 材料
Tap酶、dNTP，均购自TaKaRa公司；真菌DNA提取试剂盒，Omega公司；5311型PCR仪，德国Eppendorf公司；LPH恒温培养箱，上海鸿都电子科技有限公司。
1.2 方法
1.2.1 病原真菌总DNA的提取 将霉变红枣上刮下的菌丝洗涤、干燥，液氮研磨后转移至EP管中，使用试剂盒提取基因组DNA作为PCR反应的模板，0.8%琼脂糖凝胶电泳法检测DNA。
1.2.2 链格孢菌引物单重PCR特异性试验 根据序列比对结果，选取2对链格孢菌的特异引物：
Alt-F1：5′-TGTCTTTTGCGTACTTCTTGTTTCCT-3′；
Alt-R1：5′-CGACTTGTGCTGCGCTC-3′；
Alt-F2：5′-CTTTTGCGTACTTCTTGTTTCC-3′；
Alt-R2：5′-CAGGCATGCCCTTTGGATAC-3′。
其中：Alt-F1、R...
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