逆转录病毒载体pOZ—KLF5的构建及鉴定
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摘要：为研究KLF5的相互作用蛋白从而深入探索其生物功能，构建了C端带有FLAG、HA、6xHis三标签的pOZ-KLF5真核表达逆转录病毒栽体。pOZ-KLF5栽体可通过一次转录得到双顺反子转录单位，即一个转录物能表达两种独立存在的蛋白质：三标签融合蛋白KLF5-3xTag和筛选标记””白细胞介素-2受体a（IL-2Ra）。通过偶联IL-2Ra抗体的磁珠成功筛选出KLF5-3xTag表达阳性的293T细胞，经Western-blot检测细胞内KLF5-3xTag表达情况及其对293T细胞增殖及周期的影响，发现KLF5-3xTag能够促进细胞克隆的形成并使S期细胞增多，且可被已知E3泛素连接酶WWP1降解，与已有报道一致。进一步通过免疫沉淀实验证明了与KLF5融合的标签的免疫反应性。该质粒的成功构建为研究KLF5相互作用蛋白及深入探索其生物功能奠定了基础。关键词：KLF5；双顺反子转录；真核表达；三标签融合蛋白中图分类号：Q812文献标识码：A文章编号：1007-7847（2015）02-0124-07Construction and Characterizations of pOZ-KLF5 Retroviral PlasmidZHAO Xin-yu， WANG Wei-xi， LU Ze-lan， HUANG Lei， ZHAO Ke-wen*（Department of Pathophysiology， Shanghai Jiao Tong University School of Medicine， Shanghai 200025， China）Abstract： To analyze KLF5 interacting proteins and explore the biological functions of KLF5， the eukaryotic expression retroviral plasmid pOZ-KLF5， with the FLAG， HA， 6xHis triple tags at C-terminal， was con¬structed. Plasmid pOZ-KLF5 can get a bicistronic transcription unit after once transcription and express two independent proteins： triple-tagged fusion protein KLF5-3xTag and selection marker interleukin-2 receptor a （IL-2Ra）. 293T cells expressing KLF5-3xTag were successfully selected by the magnetic beads coupling IL-2Ra antibody， and the expression of KLF5-3xTag was detected by Western-blot. Then， the proliferation and cell cycle of 293T were tested， and the r...
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