棉花GhGGPase2基因克隆、功能序列分析、原核表达及烟草的遗传转化
摘要：以棉花纤维组织为材料，根据NCBI棉花EST进行同源搜索、比对和序列拼接，经RT-PCR从陆地棉纤维组织中扩增得到L-半乳糖磷酸化酶基因（GhGGPase2）的cDNA开放阅读框为1 335 bp，为包含445个氨基酸的蛋白质，分子质量约为49 ku。利用软件进行蛋白质序列分析，GhGGPase2蛋白具有组氨酸三聚体（HIT）蛋白超家族的主要特性的结构域。进化树分析的结果表明棉花GhGGPase2与猕猴桃AdGGPase在进化上亲缘关系上较近。构建原核表达载体pET28a-GhGGPase2并转化大肠杆菌，将重组载体pET28a-GhGGPase2导入大肠杆菌BL21（DE3）中通过IPTG诱导表达后经过SDS-PAGE分析，显示成功获得分子质量为49 ku左右的诱导表达蛋白GhGGPase2。将GhGGPase2基因构建到植物真核表达载体pCAMBIA2300中，利用农杆菌通过叶盘法转化烟草，经PCR分子鉴定，获得了含GhGGPase2转基因烟草植株。研究结果将为进一步阐明该基因的生物学功能奠定基础。
关键词：棉花纤维；L-半乳糖磷酸化酶基因；原核表达；克隆；遗传转化
中图分类号： S562.032 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2016）07-0026-05
棉花是全球重要的经济作物，也是我国重要的农产品及纺织原料，是国民经济的支柱产业之一，具有极其重要的战略地位[1]。棉花纤维品质中最重要的参考指标是纤维的强度和长度，而细胞的伸长或膨大发育与纤维的最终品质密切相关[2]。抗坏血酸是广泛存在于植物组织中的一种抗氧化小分子物质，尤其是在细胞分裂旺盛的植物组织中含量较高，不仅对植物生长发育、防卫、分化等许多生理过程起重要作用，还与细胞伸长密切相关[3-5]。棉花纤维细胞的结构是长而不分支的单细胞，是研究细胞生长发育与分化的理想材料。之前的研究表明：抗坏血酸代谢可能参与纤维的发育过程[6]。
目前已知的植物体内抗坏血酸生物合成途径中，甘露糖/L-半乳糖途径（又称为Smirnoff/Wheeler途径）是主要途径[7]。L-半乳糖磷酸化酶（GDP-L-galactose phosphorylase，GGPase）基因的表达产物是L-半乳糖磷酸化酶（GGP），该酶能够将GDP-L-半乳糖转化成GDP-L-半乳糖-1-磷酸，是甘露糖/L-半乳糖途径中的重要基因，对植物抗坏血酸的合成起着重要作用。目前已在拟南芥、猕猴桃、烟草、大豆、蓖麻、柑橘、葡萄、番茄和马铃薯等多种植物中分离出GGPase基因。通过转基因研究表明在多个物种中过量表达GGPase基因可提高植物体内抗坏血酸的含量[7-15]。
对棉花GGPase2基因的克隆、...
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