三种鸭防御素真核表达载体的构建及其表达分析
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摘要：为研究鸭防御素的真核表达，人工合成了鸭防御素AvBD2、AvBD10和AvBD12基因，并将其插入到真核表达质粒pDoubleEx-EGFP-flag-N中构建重组表达质粒；重组表达质粒经酶切鉴定正确后，分别转染HEK293细胞进行表达，用RT-PCR和Westem-blot鉴定目的基因的表达情况。结果表明，酶切鉴定证实目的基因成功插入到真核表达质粒中；真核表达质粒转染HEK293细胞24 h后，在荧光显微镜下可见绿荧光蛋白表达；RT-PCR能检测到目的基因mRNA，但Western-blot没有检测到目的蛋白的表达条带。
关键词：鸭防御素；真核表达；HEK293细胞
中图分类号：Q78 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）24-6597-04
DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.24.068
由于抗生素易导致药物残留、病原耐药性等问题，人们希望研发出安全有效的抗菌肽类药物，替代部分抗生素的使用。禽类防御素（Avian beta defensin，AvBD）作为一类重要的内源性抗菌肽，具有广谱的抗菌活性和免疫调节功能[1]，在禽类先天性免疫和获得性免疫中均发挥着重要作用。因此，禽类防御素极具新药开发价值，有望用于畜禽疾病的防控。
目前，人们已在家禽及某些野禽中发现了数十种禽类防御素，并且在大肠杆菌或酵母菌中成功表达了多种禽类防御素。然而，关于禽类防御素在动物细胞中表达的报道却很少。理论上，动物细胞能为表达蛋白提供更好地表达后加工和修饰，是表达具有天然活性蛋白的最佳宿主[2]。如果能用动物细胞表达禽类防御素，将为禽类防御素的研究和应用提供帮助。本研究根据GenBank中已发布的鸭防御素基因序列，人工合成了3种鸭防御素AvBD2、AvBD10和AvBD12基因，并构建其真核表达载体，在HEK293细胞中进行了表达研究，为鸭防御素在动物细胞中的表达提供了参考。
1 材料与方法
1.1 细胞、菌株与质粒
HEK293细胞及真核表达质粒pDoubleEx-EGFP-flag-N由长沙赢润生物技术有限公司提供；大肠杆菌DH5？琢感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司；表达猪β防御素1（PBD1）的重组质粒pDoubleEx-EGFP-flag-N-PBD1由武汉市农业科学技术研究院畜牧兽医科学研究所构建。
1.2 主要试剂
限制性内切酶、T4 DNA连接酶、DNA Mar...
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