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三种鸭防御素真核表达载体的构建及其表达分析

材料写作网    时间: 2020-09-18 04:05:41     阅读:次     手机站


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摘要:为研究鸭防御素的真核表达,人工合成了鸭防御素AvBD2、AvBD10和AvBD12基因,并将其插入到真核表达质粒pDoubleEx-EGFP-flag-N中构建重组表达质粒;重组表达质粒经酶切鉴定正确后,分别转染HEK293细胞进行表达,用RT-PCR和Westem-blot鉴定目的基因的表达情况。结果表明,酶切鉴定证实目的基因成功插入到真核表达质粒中;真核表达质粒转染HEK293细胞24 h后,在荧光显微镜下可见绿荧光蛋白表达;RT-PCR能检测到目的基因mRNA,但Western-blot没有检测到目的蛋白的表达条带。

关键词:鸭防御素;真核表达;HEK293细胞

中图分类号:Q78 文献标识码:A 文章编号:0439-8114(2016)24-6597-04

DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.24.068

由于抗生素易导致药物残留、病原耐药性等问题,人们希望研发出安全有效的抗菌肽类药物,替代部分抗生素的使用。禽类防御素(Avian beta defensin,AvBD)作为一类重要的内源性抗菌肽,具有广谱的抗菌活性和免疫调节功能[1],在禽类先天性免疫和获得性免疫中均发挥着重要作用。因此,禽类防御素极具新药开发价值,有望用于畜禽疾病的防控。

目前,人们已在家禽及某些野禽中发现了数十种禽类防御素,并且在大肠杆菌或酵母菌中成功表达了多种禽类防御素。然而,关于禽类防御素在动物细胞中表达的报道却很少。理论上,动物细胞能为表达蛋白提供更好地表达后加工和修饰,是表达具有天然活性蛋白的最佳宿主[2]。如果能用动物细胞表达禽类防御素,将为禽类防御素的研究和应用提供帮助。本研究根据GenBank中已发布的鸭防御素基因序列,人工合成了3种鸭防御素AvBD2、AvBD10和AvBD12基因,并构建其真核表达载体,在HEK293细胞中进行了表达研究,为鸭防御素在动物细胞中的表达提供了参考。

1 材料与方法

1.1 细胞、菌株与质粒

HEK293细胞及真核表达质粒pDoubleEx-EGFP-flag-N由长沙赢润生物技术有限公司提供;大肠杆菌DH5?琢感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司;表达猪β防御素1(PBD1)的重组质粒pDoubleEx-EGFP-flag-N-PBD1由武汉市农业科学技术研究院畜牧兽医科学研究所构建。

1.2 主要试剂

限制性内切酶、T4 DNA连接酶、DNA Mark...



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