鸡新城疫病毒、鸡细小病毒和禽流感病毒三重PCR检测方法的建立及应用
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摘要：【目的】建立能同時检测鸡新城疫病毒（NDV）、鸡细小病毒（ChPV）和禽流感病毒（AIV）的三重PCR检测方法，为临床上快速诊断及有效防控NDV、ChPV和AIV的单一或混合感染提供技术支持。【方法】参考NCBI中已公布NDV的F基因（登录号DQ195265.1）、ChPV的NS1基因（登录号GU214704.1）和AIV的M基因保守区（登录号DQ485211.1），设计合成针对NDV、ChPV和AIV的特异性引物，应用这3对引物建立三重PCR检测方法，对反应体系及扩增程序进行优化，并通过特异性试验、敏感性试验、重复性试验和临床样品检测等评估其实用性。【结果】优化后的三重PCR反应体系为ChPV和AIV的上、下游引物各0.5 μL，NDV的上、下游引物各1.0 μL，NDV、ChPV和AIV的核酸模板各1.0 μL，Premix TaqTM 12.5 μL，无RNase水补足至25.0 μL。最佳扩增程序：95.0 ℃预变性5 min;94.0 ℃ 1 min，58.5 ℃ 1 min，72.0 ℃ 1 min，进行35个循环;72.0 ℃延伸10 min，12.0 ℃结束反应。建立的三重PCR能同时扩增出NDV（453 bp）、ChPV（687 bp）和AIV（239 bp）的特异性条带，对应的最低检测下限分别为2.5 pg NDV、6.4 pg ChPV和2.0 pg AIV，但扩增传染性支气管炎病毒（IBV）、禽呼肠孤病毒（ARV）、马立克病毒（MDV）、传染性喉气管炎病毒（AILTV）和禽肺炎病毒（APV）等病原体均呈阴性。应用建立的三重PCR对50份鸡喉头或泄殖腔棉拭子样品进行检测，结果显示有1份NDV阳性、9份ChPV阳性和2份AIV阳性样品，其中包含2份ChPV和AIV均呈阳性的样品，1份ChPV和NDV均呈阳性的样品，与常规PCR的检测结果一致。【结论】建立的三重PCR能同时对NDV、ChPV和AIV 3种病原进行特异性诊断，在混合感染病例鉴别诊断方面具有广阔的应用前景。
关键词： 鸡新城疫病毒;鸡细小病毒;禽流感病毒;三重PCR;特异性;敏感性
中图分类号： S854.44 文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2019）11-2576-07
Development of a triplex PCR assay for detection of Newcastle disease virus，chicken parvovirus and avian influenza virus
FENG Bin， XIE Zhi-xun*， DENG Xian-wen， ZHANG Ya...
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