不同时程低氧暴露对大鼠髓源性细胞HIF—1α与hGlyrichin表达影响的研究
山东体育学院学报第30卷第6期2014年12月 沙继斌，等不同时程低氧暴露对大鼠髓源性细胞HIF-1α与hGlyrichin表达影响的研究No.6 2014已有研究证明低氧应答的核心元件HIF-1α与机体固有免疫机能存在密切联系，HIF-1α表达上调可激活血液中的髓源性细胞使固有免疫应答增强[1]，并可上调抗菌肽的表达；HIF-1α的增效剂含羞草碱[2]及近期报道的HIF-1α稳定剂AKB-4924[3]自身并无抗菌活性，但可以通过提高胞内HIF-1α表达以增强巨噬细胞与上皮细胞的抗菌活性，有效抑杀具有甲氧西林抗性的金黄色葡萄球菌。hGlyrichin是近年来发现的富含甘氨酸的新型抗菌肽家系的重要人源性成员，其结构及抗菌活性已得到初步确证[4-5]。本研究尝试同步观察不同时程低氧暴露对HIF-1α表达及hGlyrichin表达的影响，为分析二者之间的可能联系提供实验依据。
1材料与方法
1.1实验动物雄性Wistar大鼠60只，体重207±11.4 g，购自军事医学科学院实验动物中心（动物许可证号：SCXK（军）2007-004），随机分为对照组、低氧12、24、36、48、72小时组，分笼常规饲养，自由饮水、进食。采用hypoxico系统模拟海拔2500米常压低氧环境以进行间歇性低氧暴露，每日2小时。累计低氧暴露时间分别为12、24、36、48、72小时后，尾静脉收集静脉血，肝素抗凝，以淋巴细胞分离液分离去除淋巴细胞和单核细胞，然后用右旋糖酐（dextran） 沉降与低渗法去除红细胞，从而得到纯度较高的多形核白细胞，-80℃保存以备指标测定。
1.2主要试剂淋巴细胞分离液（购自Gibco），Trizol（购自Invitrogen），RT-PCR试剂盒（购自Promega），丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、SDS（购自Sigma），HIF-1α抗体（购自Abcam），IPG胶条及buffer（购自Bio-rad），常规试剂均为国产分析纯
1.3引物序列hGlyrichin上游引物： 5’-CGCATGCCGGTGGCCGTGGGT-3’， 下游引物：5’-CCGTTAGCATCGGATGCCCAT-3’；HIF-1α上游引物：5’-CTTTCTTGGAAACGAGTGAAAGG-3’，下游引物：5’-TGAGTAATTCTTCACCCTGCAG-3’；G3PDH上游引物：5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’，下游引物：5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’；均由英骏公司合成。
1.4实验方法
1.4.1RNA提取以1‰DEPC水处理所有提取RNA用品，用Trizol裂解液按照《分子克隆指南》RNA提取方法从多形核白细胞中提取RNA，所有离心操作均在4℃冷冻离心机中进行，收集RNA沉淀后在无菌操作台中风干，而后将沉淀溶于20 μl 去离子水，琼脂糖凝胶电泳鉴定...
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