双功能试剂与螯合金属元素标记多肽新技术的建立
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摘要 建立了双功能试剂2-[（4-异硫氰基苯基）甲基]-1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1，4，7，10-四乙酸（p-SCN-Bn-DOTA）与标准肽段反应的新方法，测定了反应产物与镧系金属Eu的螯合效率，探索了其作为靶向探针和蛋白定量标记试剂性能。考察了不同缓冲体系的浓度及pH值、p-SCN-Bn-DOTA量与肽段相对量、反应体系中有机相与水相比例，反应温度与反应时间对偶联效率的影响。实验结果显示： p-SCN-Bn-DOTA量为肽段的32倍，缓冲体系为0.2 mol/L TEAB （pH 8.5），60℃反应60 min， 有机相与水相之比为4.4∶1（V/V）时标记效率高；在HCl/NaAc缓冲体系（pH 4.0）中60℃反应60 min，金属离子鳌合反应效率高达94%。本研究建立了一种新的基于双功能试剂p-SCN-Bn-DOTA的标记方法，并成功用于RGD肽等的标记。
关键词 双功能试剂； 标记； 多肽； 蛋白定量； 质谱
2015-10-03收稿； 2016-03-11接受本文系北京市自然科学基金（Nos. 7143172， 7143173）资助
E-mail： shenjing69@sina.com
1 引 言
双功能试剂连接多肽并螯合金属元素，可以作为靶向探针结合分子影像技术用于肿瘤的靶向治疗研究[1]，还可以通过标记多种金属元素制备蛋白质组学多重定量试剂[2]，用于肿瘤标志物的筛选、鉴定、分类等研究。因此双功能试剂在肿瘤研究方面具有良好的应用前景。
RGD肽是一类含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg-Gly-Asp）序列的短肽，基于靶向多肽RGD进行放射性核素标记可用于αvβ3（+）肿瘤的无创性检查以及判断患者是否适用于抗肿瘤血管形成治疗[3～5]。此外，标记的小分子多肽具有生物相容性好、穿透性强、免疫原性低、作用快、易于实时监测的特点，可在基于靶向探针的蛋白的分析检测方面发挥独特优势[6，7]。
在肿瘤蛋白质组定量分析研究方面，目前已开发的方法有基于稳定同位素标记的方法，如ICAT[8]、18O酶切标记[9]、SILAC[10] 、iTRAQ [11]等，但这些方法普遍存在同位素价格昂贵、标记难度较大、对质谱分析仪器具有选择性、同位素峰在质谱分析时会发生相互干扰等缺点，会给定量结果带来误差[12]。因此探索非同位素标记的方法，开发具有我国自主知识产权的蛋白定量试剂具有重要意义。文献[13～15...
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